Итоги научно-методического семинара от 23.03.2020 "Генетика в сельском хозяйстве"

В ФГБУН «НИИСХ Крыма» в январе 2019 г. создано структурное подразделение Лаборатория молекулярной генетики, протеомики и биоинформатики в сельском хозяйстве, основным направлением работы которого является исследование генетического потенциала и молекулярных механизмов функционирования биологических процессов хозяйственно-ценных микроорганизмов, сельскохозяйственных растений и животных.

В ходе семинара по теме: "Генетика в сельском хозяйстве" было сделано 3 доклада сотрудников данной лаборатории по актуальным вопросам применения современных генетических технологий в АПК.

Первой выступила младший научный сотрудник Пузанова Елизавета Владимировна с докладом: «Генетически модифицированные организмы в сельском хозяйстве. Аргументы доказательной науки». В докладе были освещены вопросы возникновения генетически модифицированных организмов, которые произвели революцию в пищевой промышленности и сельском хозяйстве конца XX века. Со времени первых исследований прошло более тридцати лет, опубликовано множество разноплановых работ. Большинство из них, говорящих против использования ГМО, были опровергнуты за неимением четких доказательств, наличием ошибок в экспериментах и статистической обработке. Однако до сих пор вокруг этой темы не утихают споры. ГМО и ГМО-продукция исследуются с различных позиций: токсичность, аллергенность, возможность непредсказуемых процессов, устойчивость гена, что позволяет обезопасить массового потребителя. Несмотря на отсутствие четких доказательств вреда ГМО в июле 2016 года в Российской Федерации введен запрет на использование генно-модифицированных кроме как в исследовательских целях. Для контроля над данной ситуацией разработаны коммерческие тест-системы, позволяющие выявлять присутствие ГМО с помощью ПЦР в реальном времени.

Далее выступила младший научный сотрудник Загорская Маргарита Сергеевна с докладом «ПЦР метод в растениеводстве», где рассказала о ПЦР более подробно. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод молекулярной биологии, заключающийся в многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи специальных ферментов в условиях invitro. Данный метод широко используется по всему миру в различных отраслях от изучения микроорганизмов до медицинских исследований и проекта «Геном человека». В сельском хозяйстве этот метод также активно применяется.

Также Загорская М.С. рассказала, что лаборатория молекулярной генетики, протеомики и биоинформатики в сельском хозяйстве, кроме вышеупомянутого, занимается изучением эфиромасличных растений (мята, лаванда). Лаборатория молода, но в ней уже занимаются изучением генетической гетерогенности у культивируемых invitro эфиромасличных растений. Также это вопрос изучается для депонированных образцов – влияет ли длительное сохранения растений в условиях медленно растущей культуры на генетическую гетерогенность. Еще одним перспективным и многообещающим направление является паспортизация эфиромасличных растений, созданных селекционерами института.

Следующей выступила младший научный сотрудник Уппе Вероника Александровна с докладом: «Перспективы использования генетических маркеров современном овцеводстве». Овцеводство сегодня демонстрирует хорошую перспективность направления животноводства в Крыму. Интенсивное развитие молекулярной генетики дало ученым возможность идентифицировать гены и их ассоциации, несущие комплекс желательных для селекции признаков, что позволило помимо традиционного отбора животных осуществлять селекцию с применением молекулярно-генетических методов. На сегодняшний день у овец идентифицирован целый ряд генов, которые влияют на проявление хозяйственно-полезных признаков. Данные гены ассоциированы с мясной, молочной, шерстной продуктивностью, а также со стойкостью к различным заболеваниям. На базе лаборатории молекулярной генетики протеомики и биоинформатики проводятся исследования по определению полиморфизма генов гормона кальпастатина и гормона роста у овец, выращиваемых в Крыму. Полученные результаты позволяют рассматривать данные гены как перспективный маркер продуктивности овец.

Перспективы использования генетических маркеров в современном овцеводстве

Овцеводство сегодня демонстрирует хорошую перспективность направления животноводства в Крыму. Количество пастбищ дает возможность обеспечить овец кормом не только на пастбищный период, но и заготовить корма на зиму. Овцеводство обладает рядом достоинств: высокая скороспелость животных и неприхотливость в содержании, быстрый прирост поголовья, хороший спрос на мясо при невысокой конкуренции на рынке, возможность участия в льготных программах от государства для развития сельского хозяйства. Широкие адаптационные возможности овец позволяют разводить их в самых разнообразных природно-климатических условиях: в зонах степей, полупустынь, гор и высокогорий. Интенсивное развитие молекулярной генетики дало ученым возможность идентифицировать гены и их ассоциации, несущие комплекс желательных для селекции признаков, что позволило помимо традиционного отбора животных осуществлять селекцию с применением молекулярно-генетических методов. Для этого используются ДНК-маркеры, которые позволяют отобрать животных российской селекции для формирования перспективного ядра. На сегодняшний день у овец идентифицирован целый ряд генов, которые влияют на проявление хозяйственно-полезных признаков. Данные гены ассоциированы с мясной, молочной, шерстной продуктивностью, а также со стойкостью к различным заболеваниям. Наибольший интерес в мясной продуктивности вызывают такие гены-кандидаты как ген гормона роста (GH), ген кальпастатина (CAST) и кальпаина, ген миостатина (MSTN), SNP-каллипигии, ген гипофизарного фактора транскрипции (POU1F1). Безусловно, для разработки и внедрения в Республике Крым селекции на основе вышеперечисленных маркеров продуктивности, необходимо исследовать встречаемость аллельных вариантов этих генов среди местных пород овец и активнее использовать методы молекулярной биологии в овцеводстве.

Кальпастатин- специфический ингибитор кальций зависимых протеолитичесих ферментов, контролирует всю ферментную систему организма; играет значительную роль в регуляции катаболизма и анаболизма белков, развитии и распаде мускулатуры, органогенезе, клеточном цикле, движении мышечных волокон и смерти клеток. Уровень кальпастатина играет важную роль в формировании мышц, деградации и нежности текстуры мяса после убоя. Таким образом, полиморфизм овец по гену кальпастатина может применяться в качестве маркера производительности по набору веса и качества мяса. В настоящее время на базе ФГБУН «НИИСХ Крыма» в лаборатории молекулярной генетики, протеомики и биоинформатики проводятся исследования по определению генотипов гена кальпастатина и их проявления в фенотипе у овец, разводимых в Крыму. Изучаются такие породы как мериноланд, цигайская, асканийская, эдильбаевская и их помеси. Для этого у исследуемых овец отбирают кровь в ваккумные пробирки с напылением ЭДТА, выделяют ДНК, и проводят генетический анализ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сущность данного метода заключается в избирательном многократном копировании определённого участка ДНК в условиях in vitro. Первый процесс в реакции- денатурация; происходит расхождение цепей ДНК. Для начала копирования участка необходима стартовая площадка, в качестве которой выступают «затравки»- праймеры - специально подбраные олигонуклеотиды, длиной 15-20 нуклеотидов. Они комплементарны участкам ДНК-матрицы. Фрагмент, ограниченный двумя праймерами, будет копироваться ДНК- полимеразой. Полимераза- фермент, работа которого заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. За 30-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участков ДНК. Заключительный этап- элонгация ДНК- полимераза синтезирует цепь ДНК (Рис.1).

Рисунок 1. – Этапы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Для дальнейшего исследования методом ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция- полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) в пробы добавляют фермент- эндонуклеазу рестрикции и выдерживают смесь в оптимальных условиях для работы фермента (3 часа при 37 ^о С). И после электрофореза в 2 %- ном агарозном геле под ультрафиолетовыми лучами определяют аллельные варианты гена кальпастатина (M и N). 

Рисунок 2. – Электрофореграмма разделения продуктов рестрикции гена CAST у овец цигайской породы (генотипы MM – 336, 286 п.н., MN – 622, 336, 286 п.н., NN – 622 п.н; маркер молекулярных масс ДНК 100+ bp).

Генотип ММ представлен фрагментами, размерами 336 и 286 п. н., являющимися продуктами рестрикции исходного участка гена (622 п. н.) эндонуклеазой. Выявление данного генотипа возможно только при наличии в структуре нуклеотидной последовательности исходного участка гена, необходимого для узнавания ферментом (рестриктазой). Для генотипа NN характерно изменение нуклеотидной последовательности, повлекшей утрату сайта узнавания фермента. Таким образом, фрагменты не «разрезаются» ферментом, то есть остается один фрагмент, равный исходному участку гена (622 п. н.). Соответственно гетерозиготный генотип MN представлен комплексом фрагментов, размером 622, 336 и 286 п. н.

Гормон роста, или соматотропин, представляет собой белок, который состоит из 191-ой аминокислоты. Выработка и секреция данного гормона происходит в передней доле гипофиза. Из всех гормонов гипофиза, гормон роста производится в наибольшем количестве, и длится этот процесс на протяжении всей жизни. Базовый уровень достигает своего максимума в раннем возрасте животного, а пик секреции наблюдается в период полового созревания (к 6-8 месяцам у овец). Соматотропин вызывает увеличение роста и массы тела у животных. В экспериментах на трансгенных животных показано, что суперэкспрессия гена GH приводит к ускоренному росту и развитию организма животного. Гормон обладает широким спектром биологического действия, влияет на все клетки организма, определяя интенсивность обмена белков, углеводов, липидов и минеральных веществ. Он стимулирует включение аминокислот во вновь образующиеся белки. Энергией, необходимой для синтеза белка, соматотропин обеспечивает, стимулируя расщепление жиров и углеводов - в результате в крови повышается уровень глюкозы. Одновременно с этим он препятствует выделению из внутрисекреторных клеток поджелудочной железы гормона инсулина, который понижает уровень глюкозы.

На базе лаборатории молекулярной генетики протеомики и биоинформатики также проводятся исследования по определению полиморфизма гена гормона роста у овец, выращиваемых в Крыму. По результатам молекулярно генетических тестов, проводимых методом полимеразной цепной реакции – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов определяют аллельные варианты и генотипы гена GH. На данный момент известны три генотипа гена гормона роста: АА, АВ и ВВ (рис.3).

Рисунок 3. Электрофореграмма разделения продуктов рестрикции гена GH у овец цигайской породы (генотипы  – АА: 277, 202, 110, 100, 94, 68, 49, 22, 8, 4 п.о; ВВ: 256, 202, 110, 100, 94, 68, 49, 22, 8, 4 п.о; АВ 277, 256, 202, 110, 100, 94, 68, 49, 22, 8, 4 п.о; маркер молекулярных масс ДНК 100+ bp).

Полученные результаты исследования полиморфизма генов гормонов кальпастатина и соматотропина позволяют рассматривать их как перспективный маркер продуктивности овец. В настоящее время ведется работа по изучению связи фенотипических проявлений с генотипом исследуемых животных, что позволит усовершенствовать методы селекции для повышения мясной продуктивности. Планируется продолжить исследования селекционных признаков, отвечающих за продуктивные качества овец с использованием молекулярно-генетических методов.

Уппе В. А., м.н.с. лаборатории молекулярной генетики,
протеомики и биоинформатики в сельском хозяйстве veronikauppe925@gmail.com
+7 978 821 49 79